2016. október 4-én a Magyar Tudományos Akadémia Természettudományi Központjának (MTA-TTK) budapesti, Magyar tudósok körútján lévő nagytermében, „Génszerkesztés – Fehérjemérnökség” címmel klubnapot tartottunk.
A rendezvényt Sarkadi Balázs az est házigazdája, és Darvas Ferenc klub elnök nyitotta meg.
ELŐADÓINK:
- Venetianer Pál, az MTA rendes tagja, a Szegedi Biológiai Központ kutató professzora. Előadása „Genomszerkesztés. A géntechnológia új lehetőségei” címmel hangzott el.
- Pál Gábor az ELTE egyetemi docense.
Venetianer Pál előadásában elmondta, hogy a múlt század ’70-es éveiben született meg az un. rekombináns DNS-technológia, köznyelven génsebészet, forradalmasítva az élet-tudományokat. Nagyon jelentős gyakorlati alkalmazások születtek segítségével számos iparágban, a klinikai orvoslásban és a mezőgazdaságban.
Mezőgazdasági alkalmazása széleskörű társadalmi ellenállást, s törvényi korlátozásokat váltott ki. (A magyar alaptörvény tiltja is ezen technológia mezőgazdasági alkalmazását.)
2012-13 táján újabb, második forradalom is bekövetkezett a szaktudomány területén. Mindkét forradalom „közös nevezője„ az eredet, egy mikrobiológiai alapkutatási felfedezés; olyan mechanizmus kihasználása, melyet a baktériumok a fág-támadások elleni védekezésnél alkalmaznak.
Az első forradalomban az alapkutatási felfedezés az un. restrikciós (endo-nukleáz) enzimeknek a megtalálása volt, a fág-támadások elleni védekezés felderítésével. A másodiknál is egy mechanizmus felfedezése játszott szerepet.
Ezek az enzimek felismerik a DNS bizonyos egymás után következő, többnyire 4-6 bázispár hosszúságú elemeit (a palidrom-okat), s azoknál mindkét DNS láncot hasítani képesek.
A vonatkozó enzimek kizárólag baktériumokban fordulnak elő, s az idegen DNS behatolása elleni védelem a biológiai funkciójuk. Több mint háromezer ilyen enzimet ismerünk, s ezek több mint 200 különböző szekvencia-elem felismerésére képesek. Ezek az enzimek teszik tehát lehetővé a DNS meghatározott helyeken történő vágását, a génsebészetet. Az alkalmazott technika hasonlít a film-, és hangtechnikában alkalmazott vágási eljáráshoz.
A palidromok felismerése azonban nem mindig tökéletes, vannak kivételek. Ilyen kivételt jelent a FOK1 nevű enzim, amely olyan, öt-tagú, nem palidrom szekvenciát ismer fel, melynek részei egymástól jelentős távolságra, az egyik DNS-szálon 9, a másikon szálon 13 bázis távolságra helyezkednek el.
Ennek az enzimnek a szerkezetét megvizsgálva kiderült, hogy két azonos alegységből áll össze, s mindkettőben elég távol helyezkedik el két funkcionális egység, szaknyelven domén. Az egyik a felismerésért, a másik a hasításért felelős. Az a tény, hogy ez a két rész egymástól távol helyezkedik el, sugallta a gondolatot a kutatóknak, ha a felismerő részen valamilyen beavatkozást végzünk, s megváltoztatjuk a felismerést, akkor ez az enzim alkalmassá tehető az általunk megadott utasítás szerinti hasításra, nem pont a felismerő szekvenciánál. Ehhez, a fehérjék megváltoztatásához, a fehérje-mérnökség adhatja meg a kívánt adatokat.
Az elméleti elgondolás gyakorlati sikerét egy másik felfedezés tette lehetővé. Az eukariota, azaz magasabbrendű gén-szabályozást tanulmányozó kutatók felfedezték, hogy számos, a gén-szabályozásért felelős fehérjében, amely bizonyos szekvenciáknál kapcsolódik a DNS-hez, s ezáltal ott gátlást, vagy aktiválást okoz (felismer valamilyen szekvenciát), megtalálható egy érdekes szerkezeti elem, ami ezt a felismerést elősegíti. Ezt a szerkezeti elemet, közepén egy cink-ionnal, nevezik zinkUi-nak, innen ered a zinkUi nukleáz elnevezés is (2003.).
A szabályozó fehérjékben több ilyen zinkUi elem helyezkedik el egymás mellett. Mindegyik zinkUi egy-egy három nukleotidos DNS szekvenciát fed le. A természetes fehérjékben általában három zinkUi van egymás mellett, tehát 9 nukleotid specifikus szekvencia felismeréséért felelősek. Ez vezeti a fehérjéket a megfelelő szekvenciához.
Ezen felismerések birtokában merült fel az ötlet; ilyen cink-ujjakat hozzá lehetne kapcsolni a FOK1 nukleáz felismerő domenjébe, annak semlegesítésével, s így el lehetne érni, hogy a hasító rész egy másik, általunk megszabott szekvencia mentén hasítson. A fehérje-mérnöki technikával létre is hoztak ilyen mesterséges cink-kód nukleázokat, melyekben nem csak három, de több cink-ujj is helyet foglalhat, ezáltal tetszés szerint 10-15 vagy 20 fázispár hosszúságú DNS szekvencia-elemek felismerésére képes, hasítható szerkezet állítható elő.
Ilyen nukleázokat 2003-ban használták először egy megszabott szekvencia szerinti DNS-hasításra.
A több cink-ujj azt jelentette, hogy az enzim olyan hosszú szekvenciát ismer fel, ami a magasabb rendűeknél, pl. az embernél lévő természetes, 3 milliárd nukleotidot tartalmazó DNS-ben csak egyszer fordul elő. Tehát egy természetes genomot egyetlen ponton hasít.
Mire jó ez?
Amennyiben ezt a műveletet egy élő sejtben hajtjuk végre, akkor a DNS az általunk tervezett ponton meghasad. A természetes mechanizmusok ezt a hasadást ki akarják javítani. Ennek a javításnak kétféle lehetősége van, az un. nem-homolog vég-illesztés (vég-a-véghez illesztés), ill. a homológ rekombináció. Ez mehet végbe, ha a sejtben egy természetes DNS-t egy meghatározott ponton elhasítunk.
A nem-homológ végillesztésnél a két vég újra összekapcsolódik, de ebben a kapcsolódásban hiba is történhet, gyakran előfordul egy-két nukleotid kiesése, vagy pluszként való betoldódása. Tehát egy rövid betoldás, vagy kiesés keletkezik.
A homológ rekombináció esete:
ha beviszünk egy mesterséges DNS molekulát, amelynek a szerkezete, szekvenciája megegyezik azzal a hellyel, ahol a hasítást végeztük, de egy-két ponton általunk tervezett módon különbség található, akkor a hom. rekombináció mechanizmusa révén úgy áll helyre a szakadás, hogy a bevitt idegen DNS-nek a szekvenciája kerül elő.
Elő tudtunk állítani tehát olyan, nukleázzal egyetlen ponton elhasított DNS-t a sejtben, ahol ezen a ponton egy-két nukleotid-nyi kiesést hozunk létre, vagy beiktathatunk egy betoldást, egy tervezett un. pont-mutációt. Ezt a cink-ujj nukleázt használták először sejten belüli, tervezett génmódosításra 2003-ban.
2011-ben született egy ennél hatékonyabb, de elvben hasonló megoldás, a Talen technológia. Eredeti ötlete a növényi kártevőként számontartott xanthomonas baktériumból származik. Olyan fehérjékkel rendelkezik, amelyek DNS felismeréssel segítik őt a növény (paprika, alma) megtámadásában. Ezt is felhasználták a FOK1 enzim felismerő szekvenciájának módosítására a fehérje-technológia módszerével.
A Talen elem szerkezetében számos hasonló, 30-33 aminosav-hosszúságú szakasz található. Ezek azonosak, kivéve a 11. és 13. pozícióban levő aminosavat, amely különbözik az egyes elemekben. Ez a különbözés egy-egy nukleotid felismerésére alkalmas. Ezekből a Talen fehérjékből szintén elő lehet állítani olyan módosított fehérjéket, amelyek meghatározott nukleotidokat felismernek, s ezekkel is lehet tervezett módon előidézni egyetlen ponton hasítást. Ez a módszer valamivel hajlékonyabb és hatékonyabb.
Mi a nehézsége mindkét módszernek?
A fehérje-mérnökség még nem tökéletes, nem jelent biztosan tervezhető eljárási módszert. Energia-igényes és elmélyült szaktudásra van szükség hozzá, nagy felkészültséget és kiterjedt előtanulmányokat igényel, kimenetele pedig bizonytalansággal terhelt. A megfelelő kutatólaboratóriumokban az eljárást ugyan elmélyülten vizsgálták, de azért nem terjedt el széleskörűen.
Forradalmat hozott a következő fejlemény, a CrisPR technológia.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats = halmozottan, szabályos közökkel elválasztott rövid palindrom ismétlődések
A CrisPR egy DNS szekvencia-elemet jelent, amit 1987-ben egy japán kutatócsoport fedezett fel. Egy coli baktériumot tanulmányoztak részletesen, akkor fedezték fel ezt a genetikai elemet. Nem derült ki, mire is jó, s a róla szóló közlemény elmerült a dokumentumok között.
Később egy doktorandusz a spanyolországi Alicante-ben sótűrő baktériumok szerkezetét vizsgálva pontosan ugyanezt a szerkezetet találta meg, a CrisPR elnevezés tőle ered, de az elem szerepét ő sem ismerte.
Az iraki háborús készülődés idején, kormányzati felkérésre, egy francia mikrobiológus pestis-baktérium törzseket vizsgált, ő találta meg valamennyi vizsgált pestis törzsben ugyanezt a szekvenciát. Ő volt, aki megfogalmazta a sejtést, ez a szekvencia elmúlt genetikai agressziók (fág-támadások) emlék-nyoma lehet.
2007-ben egy dániai élelmiszer-kutató laboratóriumban a sajt, tejföl, joghurt készítésénél használatos baktériumokkal foglalkoztak. Egy Horvath nevű francia kutató a Danisco dán cégben a streptococcus baktériumok fág-szennyeződés miatti pusztulását, a termékek tönkremenetelét vizsgálta. A streptococcus thermophilust a joghurt készítéséhez alkalmazzák, a fág-támadás kivédése volt a feladat. A munka során ezekben a baktériumokban is megtalálták a CRISPR szekvenciát.
A munkacsoportban megfogalmazódott; ezek között a szekvenciák között van olyan, ami egy korábbi fág-támadás maradványa, s bekerült ebbe a szekvenciába. Feltételezték, amelyik szekvenciában ez benne van, az immunissá válik a további fág-támadással szemben. Sikerült ezt tapasztalatilag is igazolni, s kiderült, ha levágnak egy ilyen szekvenciából, akkor ismét érzékenyebbé válik a fág-támadással szemben. A folyamatról kiderült, működése hasonlít a magasabb rendűek immunrendszerének működésére; a fág elpusztítja a kultúra nagy részét, de annak kis hányadába beépíti a DNS-ét, ezek pedig immunissé válnak a következő fág-támadással szemben. Ez tehát a CRISPR szerepe.
Bebizonyították tehát, a beépülő DNS-darab programozni képes egy korábban inaktív nukleázt, a Cas9-et.
További kutatásban megállapították, ilyenkor a baktériumban felhalmozódik egy érdekes ribonukleinsav (RNS) molekula.
Erre alapozva kutatók elindították az első programozható in vitro rendszert, vagyis rekonstruálták azt, hogy egy kb. 100 nukleotid hosszúságú RNS és a Cas9-es nukleáz együtt alkalmazva bármilyen DNS-t egy meghatározott ponton képes hasítani. Ezt a pontot a 100 nukleotid hosszú RNS határozza meg.
A dolog újszerűsége; hogy egy ilyen hosszúságú RNS-t, ellentétben a fehérje-mérnöki eljárással, rendkívül olcsón és rutinszerűen elő lehet állítani. Jelenleg kereskedelmi forgalomban bármelyik, ezzel foglalkozó cégtől 65 dollárért beszerezhető egy ilyen, előírt szekvenciájú RNS. Természetesen, a Cas9 enzimet kódoló gén is hozzáférhető, s így sokkal olcsóbban és egyszerűbben elő lehet idézni a DNS hasítást.
Egy amerikai-kínai kutató elölt sejtekben ezt a kutatást in vitro is igazolta. (Minden idők legnagyobb összeget érintő szabadalmi pere zajlik jelenleg a témakörben…)
A lényeg; tetszés szerinti magasrendű állati, vagy növényi sejtben egy kb. 100 nukleotid hosszúságú RNS és egy fehérjebontó enzim génjének bevitelével elő lehet idézni bármely ponton a tervezett DNS-hasítást.
Ez a módszer sem tökéletes azonban. Hátulütője; a hasítás kimenetele nem egyértelműen meghatározott, többféle lehet, s ezt a tényt tervezetten befolyásolni nem nagyon lehet. Ki kell választani egy sejtkultúrában a számunkra kívánatos sejtet, amelyben a számunkra szükséges válasz létrejött. Ez fáradságos és intuitív-igényes munka, amelynek kiváltására, egyszerűsítésére történtek módosítások.
Gond az is, hogy ez a hasítás ugyan rendkívül precíz, biztosan hasít ott, ahol akarjuk, de 1-2% lehetőséggel az ehhez némileg hasonló, de tőle különböző szekvenciára is hat, a tervezett helytől eltérő pozíciónál is hasíthat.
Ez állatoknál, növényeknél nem okoz gondot, de a módszert embernél is akarják majd alkalmazni, ahol már problémát jelenthet. Világszerte jelentős erőfeszítések történnek, hogy pontosabban működő nukleázokat találjanak. Vannak is idevágó eredmények, megpróbálják módosítani a Cas9-et, ill. vannak nukleázok, amelyek a Cas9-nél jóval pontosabban hasítanak.
Egy másik munkacsoport javított módszerrel dolgozik, melynek kialakítója a magyar szecesszió jelentős építészének, Komor Marcellnek leszármazottja, Komor Alexis.
Ők a Cas9 enzimet egy mutációval inaktiválták, ilyenkor az enzim ugyan odakapcsolódott, de nem hasított. Hozzákapcsolták a citimin deanimáz enzimet. Ennek eredményeként, az RNS odavezeti a tervezett DNS szekvenciához az egész komplexumot, de ott nem hasítás történik, hanem a meghatározott ponton egy citimin uracyn-ná alakul, így a DNS GC bázispárból HT bázispár keletkezik, tehát pont-mutáció jön létre.
Ennél a módszernél tehát nem kell keresgélni a megfelelő kimenetelt, s hogy hol van kiesés, hol van betoldás, s milyen mutációk jönnek létre.
A kutatási területen hatalmas sebességgel születnek új eredmények, úgy a Cas9 enzim hasítási pontossága növelésére, mint a pont-mutáció még pontosabbá tételére.
Milyen lehetőséget kínál ez a technológia az alapkutatás és az alkalmazás számára?
Alapkutatási alkalmazások:
Egy tetszés szerinti genomban szűrni tudjuk, hogy a gének közül melyek a létfontosságúak (azonosíthatjuk a recepciót). Szűrés a lehetséges gyógyszer-célpontokra.
Szűrés a nem kódoló DNS régiókban olyan mutációkra, amelyek a gén-kifejeződésben nem jelennek meg. (Számos betegséget okozó mutáció itt található.)
Fokozható, csökkenthető vagy megszüntethető egy célzott gén in vivo aktivitása. Tervezett epigenetikus beavatkozásokat lehet végezni.
Alkalmazások:
Beépíthető a sejtbe olyan rendszer, amely regisztrálja-memorizálja a sejt életében történt eseményeket. A fejlődés és az evolúció összefüggéseit lehet tanulmányozni. Mutáció okozta betegségek gén-terápiás gyógyítása. (Egyenlőre állatokon eredményes.) Vírusok elleni védekezés kialakítása. Patogén baktériumtörzsek kiirtása kultúrákból.
„Hajcsár-gén” technológia – a zika vírust, vagy a malária kórokozóját terjesztő szúnyogoknál hím-sterilitást idéznek elő, s a változások terjedési sebességét hatalmasan megnövelik. Ipari baktériumtörzsek védelme.
A társadalmi és törvényi korlátok a hagyományos génsebészeti technológia ellenében születtek, a fentiekben tárgyaltak szerint azonban a génsebészet újonnan tapasztalható változásai kikerülik ezeket. Nincs szó idegen DNS beviteléről, a konstruált változatok nem különböztethetők meg a természetesen létrejövő megváltozásoktól. A géntechnikai beavatkozás kimutatása nem lehetséges.
Ez a tény gyakorlatilag patt-helyzetet teremtett a GMO szervezetek körüli vitákban a világon. A cégek, amelyek ezt képesek alkalmazni és szeretnék is használatba venni, egyenlőre nem mernek piacra lépni, mert az új fejlemények törvényi szabályozása még nem tisztázott.
A géntechnológia ellenfelei, a különböző zöld szervezetek kétségbeejtő helyzetben vannak, mert nem tudják definiálni az ellenséget. Gyűlölik a dolgot, de nem tudják, hogy mit gyűlölnek.
Az USA-ban azonban egy konkrét, a Talen technológiával előállított konstrukció, egy nem barnuló csiperkegomba szerzői a hatósághoz fordultak, s a hatóság kijelentette, nem tartozik rá. Azaz, nem szükséges semmiféle ellenőrzés és szabályozás. A svéd hatóságok is nyilatkoztak már hasonló módon…
Pál Gábor előadása a „Fehérjeszerkesztés. Mérnökség kontra irányított evolúció.„ címet kapta.
A fehérje-fehérje kölcsönhatások során rendszerint több száz atom vesz részt másodlagos kölcsönhatásokban.
A folyamatban nagy felületek temetődnek el, a fehérjék térszerkezete módosulhat. A folyamat összetettsége miatt jelenleg nincs olyan számítási módszer, amivel két kölcsönható fehérje, illetve ezek komplexének szerkezete ismeretében kielégítő pontossággal meg lehetne jósolni, milyen erős a kialakult kölcsönhatás. Az sem jósolható kellő pontossággal, hogy a stabilitáshoz az egyes atomcsoportok (például oldalláncok) milyen mértékben járulnak hozzá. Emiatt az egyes mutációk hatása sem jósolható, tehát nem tudunk hatékonyan újfajta, valamilyen elvárásoknak megfelelő fehérje változatokat tervezni.
A fenti problémák megoldása hatalmas mennyiségű, új fehérje mutánsok kölcsönhatásaira vonatkozó mérési adatot igényel. Ezek olyan szekvencia-aktivitás adatsereget szolgáltatnak, amely elengedhetetlen kiindulópontja a kölcsönhatási energiát számító algoritmusok továbbfejlesztésének. A mutánsok hatalmas tömegű egyedi előállítása rendkívül költséges, és bizonyos számú variáns felett praktikusan nem finanszírozható.
Egy ötletes kerülőúttal mindez megoldható oly módon, hogy nem egyenként állítunk elő mutánsokat, hanem kombinatorikus mutagenezis eljárásokkal készítünk hatalmas, többmilliárd tagszámú mutáns könyvtárakat.
A mutánsok génjét monoklonális módon bakteriofágon fejezzük ki, ahol is a mutáns génje fizikailag össze van kapcsolva a kódolt fehérjével. Irányított evolúciós eljárással szelektáljuk azokat a variánsokat, amelyek egy számunkra fontos funkcióval, általában egy adott molekulához való kötőképességgel rendelkeznek. Az így elkülönített alkönyvtárból statisztikailag elegendő számú klón DNS-alapú szekvenálásával kideríthető, hogy az adott kötőtulajdonság ellátásához milyen fehérje szekvencia szükséges.
A módszerrel olyan hasznos, a természetben nem létező fehérje formákat hozunk létre, amelyek kiemelkedően hasznosak lehetnek a gyakorlatban, például gátolhatnak olyan enzimeket, amelyek ellen korábban nem rendelkeztünk inhibitorral (gátló anyaggal).
Laboratóriumunkban sikeresen alkalmazzuk ezt a megközelítést fehérjék szerkezet-funkció kapcsolatainak megértésére és új, hasznos variánsok létrehozására. A technológia segítségével tavaly bizonyítottuk, hogy a reverzibilis szerin proteázokra vonatkozó, több évtizede érvényesnek hitt szabályrendszer, a Laskowski modell nem általános érvényű.
Sikereket értünk el egymással közeli rokon enzimek eltérő tulajdonságainak feltérképezésében, és az említett megközelítéssel sikerült inhibitorokat fejlesztenünk humán komplement proteázok ellen is. A módszer arra is alkalmas, hogy feltárjuk egyes peptidkötő fehérjék optimális kötőpartnerének szekvenciáját, ami segíthet a valós kötőpartnerek azonosításában. Mindezek mellett a labor tRNS-ek és aminoacil tRNS szintetázok kapcsolatának bioinformatikai és kísérletes vizsgálatában is érdekelt.
A jegyzetet készítette: Harmat Lajos újságíró. Közzétéve: EuroAstra Internet Magazin.